命门穴的准确位置在人体后正中线上，位于第二腰椎棘突下凹陷中。取穴时可采取俯卧位或正坐位，找到两侧髂嵴最高点的连线（通常平对第四腰椎棘突），向上循摸两个棘突即为第二腰椎，其下方的凹陷处即为命门穴。
该穴位处于腰背部正中，与肚脐处于同一水平线相对的位置。体表定位时，可让受试者显露腰部，医者用拇指沿脊柱中线向下滑按，触及明显的骨性凸起后，在第二腰椎棘突下方的软组织凹陷处可触及敏感点，此处按压时通常会有酸胀感。
需要说明的是，穴位定位存在个体差异，实际应用中需结合解剖标志和触诊综合判断。若用于艾灸、针灸等治疗，建议在专业中医师指导下操作，以确保取穴准确性和操作安全性。日常保健按摩时，可用掌心搓热后温敷该区域，但需注意避免过度用力造成软组织损伤。