褪黑素主要由松果体分泌，也可能由视网膜、胃肠道等器官少量合成。其分泌水平受昼夜节律调节，通常在夜间达到高峰，有助于维持正常睡眠-觉醒周期。
1、松果体
松果体位于间脑顶部，是褪黑素的主要分泌器官。其分泌活动受光照条件影响，光线通过视网膜-下丘脑通路抑制松果体活动，黑暗环境则会促进褪黑素合成。松果体细胞将色氨酸转化为5-羟色胺，再通过乙酰化和甲基化反应生成褪黑素。
2、视网膜
视网膜神经细胞能够局部合成少量褪黑素。这些褪黑素不进入全身循环，主要参与调节视网膜自身的昼夜节律功能，影响感光细胞的代谢活动和对光刺激的适应性反应，帮助维持眼部生物钟与中枢生物钟的同步性。
3、胃肠道
肠嗜铬细胞可分泌微量褪黑素，约占人体总量的400倍。这些褪黑素主要作用于消化道局部，通过调节胃肠蠕动、胃酸分泌和黏膜修复等过程维持消化功能，其分泌量与进食时间、食物成分存在相关性。
日常应保持规律作息，避免夜间强光暴露影响褪黑素正常分泌。若存在睡眠障碍等问题，建议在医生指导下进行褪黑素水平检测，不可自行长期服用外源性褪黑素制剂。